基因表達調控是決定細胞命運的重要因素，通過改變基因的表達模式即可實現對細胞命運的精準調控。比如運用Yamanaka四個轉錄因子（Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc）在體外就可將體細胞成功重編程為誘導多能幹細胞。2020年6月10日，betway体育下载 /廣州再生醫學與健康廣東省實驗室姚紅傑課題組聯合清華大學生命科學學院孫前文課題組在國際學術期刊Science Advances在線發表了題為R-loops Coordinate with SOX2 in RegulatingReprogramming to Pluripotency的研究論文，該研究成果揭示了SOX2/Ddx5與R-loop協同調控體細胞重編程的新機製。

在基因轉錄過程中，會形成一種由單鏈DNA和DNA:RNA雜合鏈組成的三鏈核酸結構，稱為R-loop。R-loop廣泛存在於各個物種中，最早被認為是轉錄的副產物，但近年來發現R-loop在很多生物學過程中發揮著重要的作用。已有研究報道R-loop相關蛋白很多都是RNA結合蛋白（RBP），然而RBP如何協同R-loop在細胞命運決定中發揮作用尚不清楚。早在2017年，姚紅傑課題組在國際學術期刊Cell Stem Cell已經揭示了RBP Ddx5通過調節miR-125b代謝從而負向調控PRC1複合物的非經典亞基RING1和YY1結合蛋白（RYBP）的雙重功能，進而調控體細胞重編程為誘導多能幹細胞。但是Ddx5作為RNA解旋酶在體細胞重編程中的功能仍然未知。

研究團隊運用ssDRIP-seq技術，首先繪製了體細胞重編程過程中R-loop的動態變化圖譜，發現R-loop並不是簡單地作為轉錄的副產物出現，而是在轉錄發生變化之前就開始變化。根據R-loop的分布特點，結合多組學分析發現R-loop變化與染色質開放程度及增強子活性存在很高的正相關性，並與體細胞重編程過程密切相關。研究人員發現敲降R-loop的重要調控蛋白RNaseH1的表達可抑製體細胞重編程的進程。為了研究R-loop與體細胞重編程的關係，研究人員構建了RNaseH1突變體。體外實驗表明RNaseH1酶活位點單個氨基酸的點突變體（RNaseH1^D209N）可以顯著抑製野生型RNaseH1對R-loop的消解作用。重編程實驗表明RNaseH1^D209N可以改變R-loop水平進而影響體細胞重編程的進程。

因子篩選實驗表明Yamanaka四因子中隻有Sox2可以回複因R-loop改變而被抑製的重編程。與對照組相比，過表達Sox2處理組中重編程細胞的R-loop水平更高。結合組學數據及生物信息分析發現Sox2結合位點附近的R-loop水平較高，而且在重編程過程中增加Sox2的表達量可以增加相關位點R-loop水平。結合RNA-seq及ssDRIP-seq數據發現Sox2促進多能性基因相關位點的R-loop富集。進一步生物信息分析發現Sox2調控的R-loop更傾向位於基因的啟動子區域。

研究發現雖然Sox2可以與R-loop形成複合物，但EMSA實驗結果表明Sox2並不具有直接結合R-loop的能力，而是間接參與調控R-loop水平的變化。為了揭示Sox2與R-loop的調控關係，研究人員通過質譜數據發現Sox2與RNA解旋酶Ddx5存在相互作用。體外R-loop消解實驗揭示Ddx5解旋酶可以直接消解R-loop，而Sox2與Ddx5相互作用並抑製DDX5對R-loop的消解作用。研究還發現Sox2通過其DNA結合結構域（HMG區域）抑製Ddx5對R-loop的消解作用。

該研究進一步發現Sox2這一新功能並不依賴於Sox2的轉錄因子活性。體細胞重編程實驗發現Sox2可回複因Ddx5而被抑製的重編程進程以及上調Ddx5相關調控位點的R-loop水平，進而促進體細胞重編程為多能幹細胞。這項研究發現了Sox2/Ddx5協同調控R-loop參與體細胞重編程過程，闡明了R-loop對細胞命運調控的重要作用，並揭示了Sox2這一傳統轉錄因子的新功能。

betway体育下载 /廣州再生醫學與健康廣東省實驗室姚紅傑研究員與清華大學生命科學學院孫前文研究員為本文的共同通訊作者。姚紅傑課題組博士生李堯益、宋亞威和孫前文課題組博士後徐煒、博士生李沁為本文共同第一作者。該課題的實施得到了來自中國科學院生物物理研究所薛願超研究員和德國馬普協會分子醫學研究所Hans Scholer研究員的幫助。該工作得到來自國家重點研發計劃幹細胞專項、國家傑出青年科學基金、中國科學院戰略性先導科技專項、廣州再生醫學與健康廣東省實驗室、清華-北大生命科學聯合中心等項目經費的支持。

論文鏈接

圖1. R-loop水平變化影響體細胞重編程。

圖2. Sox2/Ddx5協同調控R-loop。

圖3. 本研究的模式圖。