近日，betway体育下载 賴良學課題組在Science China Life Sciences在線發表了題為Double knock-in pig models with elements of binary Tet-On and phiC31 integrase systems for controllable and switchable gene expression的研究論文，這項研究成功建立了僅需一輪體細胞克隆，即可獲得可穩定遺傳的藥物調控外源基因表達的工具豬模型。

高表達外源基因的基因修飾豬在生物醫藥和農業領域具有重要的研究和應用價值。在豬體內引入可誘導基因表達係統，可以對外源基因表達進行精準的時空調控，有利於基因功能的深入剖析和拓展基因修飾豬的應用範圍。長期以來，由於技術困難，穩定、高效的可誘導表達外源基因工具豬模型一直未能建立。隨著基因編輯技術的快速發展，高效構建各種類型的基因突變，包括單基因敲入、單或多基因敲除/點突變的基因修飾豬模型成為可能，這為在豬上構建穩定可靠的可誘導基因表達體係提供了技術保障。

在研究過程中，該團隊首先采用雙位點定點敲入的策略，借助兩種不同的抗性基因表達盒進行細胞篩選之後，結合體細胞克隆獲得了四環素（Dox）誘導報告基因表達的工具豬模型。

為了提高後續獲得Dox誘導其它基因表達豬模型的效率，在報告基因兩側引入了能被PhiC31重組酶識別的attP位點。在細胞以及克隆胚胎水平均能實現PhiC31介導的基因表達盒式置換，獲得Dox誘導其它任意基因的基因修飾豬細胞，由此繞過複雜而又低效的傳統基因敲入步驟。據此，該團隊建立了過表達EGFP、hKRAS^G12D及OSKM的豬細胞係。

原癌基因KRAS^G12D突變是腫瘤病人中最常見的突變類型之一，條件性表達KRAS^G12D的動物模型在腫瘤研究中占有重要的作用。利用前述Dox誘導基因表達豬模型，該團隊進一步建立了Dox誘導hKRAS^G12D（DIK）表達的豬品係。對從DIK豬分離獲得的耳朵成纖維細胞及胎兒成纖維細胞進行Dox誘導，發現誘導後成纖維細胞具有更強的增殖能力，提示了其轉化成腫瘤細胞的潛力。接著對7月齡的DIK豬進行長期的體內Dox誘導實驗，在誘導後第8個月左右，DIK豬鼻子、口腔、陰囊部位出現腫瘤樣增生，腫瘤樣品表達鱗狀細胞癌標誌物CK5/6、CK18。進一步轉錄組測序分析表明，不同部位腫瘤樣品間具有更相似的基因表達譜；GO分析富集到了細胞遷移、細胞運動、細胞粘附、細胞周期、細胞群體增殖和細胞通訊等生物過程；KEGG通路分析表明代謝及腫瘤等信號通路發生改變；Ras信號通路相關基因表達分析發現，許多活化Ras的下遊效應蛋白，例如AFDN、PIK3CB、RASSF5、TIAM1、RIN1、RALBP1、RAPGEF5、PIK3R2和RALGDS均顯著上調。綜上，Dox誘導hKRAS^G12D表達可以驅動DIK豬體內腫瘤發生，DIK豬品係是腫瘤生物學研究的有力工具。

此外，可誘導表達外源基因工具豬，也是一種寶貴的基因資源，為後續建立各種用途的豬模型提供了極大便利。雙位點敲入豬遵循孟德爾遺傳定律，將Dox誘導報告基因表達豬與野生型豬交配擴繁，可獲得四種不同基因型(Rosa26^rtTA/WTHipp11^{TRE3G-tdTomato/WT},Rosa26^WT/WTHipp11^{TRE3G-tdTomato/WT},Rosa26^rtTA/WTHipp11^WT/WT和Rosa26^WT/WTHipp11^WT/WT）後代。例如，對於Rosa26^rtTA/WTHipp11^{TRE3G-tdTomato/WT}基因型豬，可以將細胞水平的重組酶介導的基因盒式置換與體細胞核移植相結合，培育Dox誘導目的基因表達豬模型；鑒於體細胞核移植低效且昂貴，而基因盒式置換在胚胎中非常高效，因此，也可以采用將phiC31 mRNA和供體DNA直接注射到源自Dox誘導報告基因表達豬群的受精卵的方法培育Dox誘導目的基因表達豬；對於Rosa26^WT/WTHipp11^{TRE3G-tdTomato/WT}基因型豬，可以通過由組織特異性啟動子控製的rtTA元件的單位點敲入，培育可用於譜係追蹤的組織特異性誘導報告基因表達豬模型；類似地，對於Rosa26^rtTA/WTHipp11^WT/WT基因型，可以通過單位點敲入TRE3G驅動目的基因表達盒，培育Dox誘導表達豬品係。

本研究中，betway体育下载 賴良學課題組金琴博士為第一作者，賴良學研究員和王可品副研究員為共同通訊作者。該研究成果得到了國家重點研發計劃、國家自然科學基金、廣東省科技計劃、海南省重大科技計劃、中國科學院青年創新促進會和中國科協青年人才托舉工程等項目的資助。

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可誘導外源基因表達工具豬的應用